Métodos Atuais de Extração de Ácido Nucleico

Métodos Atuais de Extração de Ácido Nucleico

PARTE 1

A extração de ácido nucleico (NAE) é uma das etapas mais importantes da biologia molecular, sendo usada rotineiramente em muitas áreas das ciências biológicas e médicas, pois este procedimento marca um ponto de partida em qualquer kit de diagnóstico molecular [1].Este procedimento crucial é conhecido há mais de um século e desenvolveu-se substancialmente nas últimas décadas.No entanto, ainda é necessário alcançar algum progresso para que os protocolos NAE deixem os ambientes laboratoriais e entrem no “mundo real” do diagnóstico no local de atendimento (POC-Dx).

Hoje em dia, sabe-se que os ácidos nucleicos intracelulares (NAs) podem ser amplamente categorizados como genômicos (ou cromossômicos), plasmídeos e diferentes tipos de RNAs.Embora os RNAs possuam uracila enquanto os DNAs apresentem timina, os ácidos nucléicos exibem propriedades bioquímicas básicas semelhantes, mas podem ter estruturas tridimensionais bastante distintas (genômica, plasmídeo, tRNA, mRNA, rRNA, etc.).No entanto, apesar das diferenças estruturais, os métodos mais comumente utilizados descritos no presente texto podem ser aplicados ao DNA em seus diversos formatos organizacionais (cromossômico, plasmídico, etc.), bem como ao RNA e seus formatos multidimensionais (mRNA, rRNA, tRNA). , miRNA, etc.) com pequenas modificações.

O NAE pode ser dividido aproximadamente em quatro etapas, que podem ser moduladas dependendo da amostra e das aplicações a jusante: (i) ruptura celular;(ii) remoção de lipídios de membrana, proteínas e outros ácidos nucleicos, (iii) purificação/ligação de ácidos nucleicos do volume;e (iv) concentração de ácido nucleico.

A ruptura ou desintegração celular pode ser conseguida por métodos físicos e/ou químicos, cujo principal objectivo é romper a parede celular e/ou as membranas celulares.Os métodos de ruptura baseiam-se principalmente nas propriedades da amostra e, para este fim, uma ampla gama de ferramentas e abordagens são utilizadas isoladamente ou combinadas para obter a ruptura de tecido/célula.Enzimas líticas, agentes caotrópicos e diferentes tipos de detergentes são os principais componentes da lise química, enquanto o método mecânico rompe as células por trituração, cisalhamento, batimento de esferas e choque.É interessante notar que se uma técnica não produz bons resultados, outra pode ser bem sucedida.Os métodos de choque osmótico produziram, em certos casos, melhores resultados do que os protocolos comuns de purificação de NA, como extração com fenol-clorofórmio e batimento de esferas.A ruptura celular não é apenas importante para a extração de DNA, mas também desempenha um papel crucial na indústria biofarmacêutica, uma vez que muitas proteínas recombinantes e outros constituintes importantes da célula podem ser recuperados através deste processo.Outra abordagem para a ruptura celular é o uso de diferentes métodos em combinação.Um bom exemplo é o caso da lise enzimática, onde muitos protocolos utilizam proteases para libertar o NA do seu andaime proteico protetor.Além disso, a inativação de nucleases celulares que se libertam em solução para proteger o novo NA livre de proteínas é crucial.Uma combinação de detergentes e sais caotrópicos em uma única solução é usada para solubilizar a parede celular e/ou membrana celular e inativar nucleases intracelulares.A ruptura mecânica, por outro lado, utiliza a força para extrair constituintes da célula.Um exemplo clássico de moagem em biociências é o uso de almofariz e pilão, hoje otimizado com o uso de nitrogênio líquido (quando permitido pela amostra).As paredes celulares também podem ser rompidas pelas ondas de choque criadas pelas rápidas mudanças na pressão provocadas pela sonicação ou cavitação.Outras ferramentas mecânicas disponíveis para a ruptura celular são o cisalhamento, que utiliza uma força tangencial para fazer um buraco na célula, e o batimento de esferas, que utiliza diferentes esferas de vidro ou aço para romper a parede celular resistente, conforme mencionado..

Os métodos NAE abrangem a extração de DNA e RNA, mas podem ser caracterizados mais amplamente em métodos quimicamente conduzidos ou em fase sólida;ambos contêm as quatro etapas mencionadas acima.Nas próximas seções, revisaremos o princípio de funcionamento e/ou a justificativa dos principais métodos utilizados atualmente nas ciências biológicas e médicas.Como o diagnóstico molecular depende fortemente de técnicas que começam com NAE, também discutiremos algumas das características básicas dos dispositivos disponíveis para POC-Dx, culminando com os desafios e limitações da adaptação dos métodos NAE aos testes de diagnóstico no local de atendimento.