A tecnologia de reação em cadeia da polimerase (PCR) é um elemento básico de inúmeros laboratórios de pesquisa e testes, em uma variedade de campos, incluindo biomedicina, diagnóstico clínico, testes de microbiologia alimentar e perícia criminal.Esta tecnologia fundamental utiliza ciclos térmicos para facilitar uma série de reações nas quais uma amostra de DNA é replicada rápida e exponencialmente para produzir milhões ou bilhões de cópias da sequência.Ao adquirir um novo sistema de PCR, é importante considerar os objetivos finais da sua aplicação, a precisão e eficiência do equipamento de ciclagem térmica e a capacidade e flexibilidade do instrumento.Este artigo fornece uma visão geral das diferentes opções e recursos disponíveis para sistemas PCR para ajudar a definir um sistema adequado para sua aplicação.
1. PCR x qPCR x dPCR
Embora todos os sistemas de PCR repliquem o DNA usando a reação em cadeia da polimerase, existem diferentes metodologias usadas por diferentes sistemas para alcançar resultados específicos.Entre esses métodos diferentes estão a PCR padrão, a PCR quantitativa (qPCR) e a PCR digital (dPCR).
Máquinas de PCR padrão são normalmente usadas para amplificar DNA para testes e uso posteriores;em certo sentido, esta tecnologia é usada como um meio para gerar um produto final e não como um método de teste analítico em si.O DNA amplificado pode ser medido somente após a reação de PCR, se completa, e não em tempo real e, portanto, este método é algumas vezes chamado de PCR de ponto final.O produto final da amplificação por PCR tradicional é comumente usado para clonagem e sequenciamento downstream, e também pode ser verificado usando eletroforese em gel para confirmar a presença de sequências alvo e sua quantidade relativa em baixa resolução (com base na intensidade da banda).
Para uma quantificação mais rápida e precisa da quantidade de sequência alvo presente numa amostra, a PCR quantitativa (qPCR), também conhecida como PCR em tempo real, utiliza sondas fluorescentes durante o processo de amplificação para monitorizar a quantidade de ADN presente após cada ciclo térmico.Ao observar quantos ciclos são necessários para atingir um determinado limite de intensidade de fluorescência, o analista pode determinar a quantidade de DNA no material de partida ao comparar os resultados com uma curva padrão.O qPCR também pode confirmar a presença ou ausência de uma sequência alvo mais rapidamente do que o PCR de ponto final e, portanto, é usado em aplicações de diagnóstico, como a detecção de SARS-CoV-2 (usando transcrição reversa para primeiro converter o RNA viral em cDNA).
PCR digital (dPCR) é outro método quantitativo no qual as reações de PCR ocorrem em milhares de câmaras de reação separadas, e o número absoluto de moléculas de DNA na amostra original pode ser determinado com base em quantas câmaras de reação produzem um sinal fluorescente após a amplificação estar completa .Ao contrário do qPCR, as medições fluorescentes não são realizadas em tempo real e não é necessária uma curva padrão para quantificar o DNA na amostra.Embora o dPCR normalmente tenha rendimento limitado e custos mais elevados do que o qPCR, ele é mais preciso, sensível e preciso na quantificação de DNA e é especialmente útil em aplicações como a detecção de mutações raras e polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs).
A determinação de escolher PCR de ponto final (qualitativo/semiquantitativo) versus um método quantitativo (qPCR ou dPCR) é relativamente simples quando você considera sua aplicação, mas a escolha entre qPCR e dPCR pode ser mais sutil.O qPCR é de alto rendimento, econômico e suficientemente sensível para muitas aplicações, mas o dPCR pode ser uma escolha melhor se a quantificação absoluta com baixos limites de detecção for fundamental.
2. A importância do controle de temperatura
A capacidade dos termocicladores de ajustar e controlar com precisão e eficiência a temperatura das amostras é o que permite o sucesso das reações de amplificação e deve ser o foco central na seleção de qualquer sistema de PCR.Diferentes sistemas podem oferecer diferentes capacidades em relação às taxas de rampa, uniformidade e precisão de temperatura e a capacidade de atingir gradientes de temperatura entre blocos térmicos para auxiliar na otimização do método de PCR.
A taxa de rampa refere-se à velocidade das mudanças de temperatura entre as etapas do ciclo térmico e é normalmente expressa em graus Celsius por segundo (°C/seg) nas especificações do instrumento.Os fabricantes podem fornecer informações sobre as taxas máximas de rampa e as taxas médias de rampa, bem como diferenciar entre as taxas de subida (aquecimento) e as taxas de descida (resfriamento) de um instrumento.Em geral, taxas de rampa mais altas correspondem a tempos de execução mais rápidos, mas os compradores devem ter cuidado ao focar em taxas de rampa máximas sem examinar outras métricas relacionadas à velocidade do instrumento.Um instrumento só pode atingir sua taxa de rampa mais alta por um curto período de tempo, e a taxa de rampa média refletirá melhor o ritmo das mudanças de temperatura.Embora as especificações de taxa de rampa possam dar uma ideia geral de quão rápido determinados instrumentos podem funcionar, quando possível, procure dados sobre tempos de execução reais demonstrados em um instrumento para obter uma imagem realista de como altas taxas de rampa se traduzem em análises rápidas.
A precisão e a uniformidade da temperatura também são fundamentais para reações bem-sucedidas e, embora todos os termocicladores sejam projetados para produzir as temperaturas necessárias para PCR, certos recursos podem oferecer um maior grau de confiança, o que é crítico para aplicações nas quais as amostras podem ser limitadas e os resultados confiáveis são fundamental, como em diagnóstico clínico e forense.O controle preciso da temperatura também é crucial ao usar a máquina de PCR para técnicas sensíveis, como análise de fusão de alta resolução (HRM).Uma tampa aquecida pode garantir melhor uniformidade de temperatura em todo o tubo PCR, pois sem tampa aquecida a amostra pode evaporar e condensar no topo do tubo, onde a temperatura é mais baixa.O design do bloco térmico também afeta o controle da temperatura;os blocos de alumínio são a opção mais econômica, mas são os menos condutivos, o que significa que atingirão a uniformidade de temperatura mais lentamente e terão taxas de rampa mais baixas do que os blocos mais condutivos.Os blocos revestidos de prata e ouro são mais caros, mas permitem que a transferência de calor ocorra mais rapidamente, garantindo uma distribuição uniforme da temperatura no bloco.
Diferentes alvos de ADN podem exigir temperaturas diferentes para alcançar os melhores resultados de amplificação;por exemplo, sequências ricas em GC necessitam de temperaturas mais elevadas para desnaturação.As temperaturas ideais de recozimento também são afetadas por uma série de fatores - embora as temperaturas para esta etapa sejam geralmente selecionadas com base nas temperaturas de fusão dos primers, nas diferenças nas temperaturas de fusão entre pares de primers e na influência da concentração do reagente, do pH e da concentração de sal. tornam a otimização das condições de temperatura de reação uma tarefa complicada. As máquinas de PCR com capacidade de gradiente de temperatura são projetadas para auxiliar na otimização de métodos de PCR, permitindo que múltiplas temperaturas de recozimento sejam testadas em uma única execução.Dependendo dos tipos e da diversidade de amostras que você planeja analisar usando sua máquina de PCR, a escolha de um instrumento com recursos de gradiente pode valer o custo adicional para economizar tempo significativo e otimizar reagentes novos protocolos em menos execuções.
3. Blocos térmicos
Conforme mencionado, o bloco térmico usado com um instrumento PCR pode fazer a diferença no controle de temperatura, mas o design do bloco – e o design do instrumento para acomodar diferentes blocos – também impacta o rendimento, os custos de consumíveis e a flexibilidade.Os blocos típicos virão em formato de 96 ou 384 poços, embora outros formatos, como 48 poços e 1.536 poços, também estejam disponíveis.Uma contagem de poços mais elevada permite um rendimento mais elevado com volumes de reacção mais baixos, o que inicialmente será mais dispendioso, mas em última análise reduz o preço por reacção devido ao menor volume de reagente utilizado para cada poço.A consideração de quantas amostras você processará e com que frequência usará a máquina determinará se um bloco térmico com contagem de poços menor ou maior será mais prático e econômico para o seu laboratório.
Alguns instrumentos vêm com um formato de bloco fixo, enquanto outros permitem o uso de blocos intercambiáveis, oferecendo mais flexibilidade para alternar entre formatos de 96 e 384 poços ou entre diferentes materiais de bloco para diferentes aplicações.Alguns termocicladores também acomodam vários blocos no mesmo instrumento, permitindo que diferentes protocolos sejam executados em diferentes conjuntos de amostras ao mesmo tempo.3 Blocos com dimensões 'universais' aumentam ainda mais a flexibilidade para usar tubos, tiras ou placas de PCR de diferentes tamanhos. como necessário.
Devido ao papel fundamental deste componente no controle de temperatura, manuseio de amostras e rendimento, as opções de bloco térmico devem ser cuidadosamente consideradas ao selecionar um termociclador.Para laboratórios com um baixo volume de amostras, ou aqueles que executam rotineiramente apenas alguns ensaios, instrumentos de bloco fixo de baixo custo com formato padrão de 96 poços podem ser suficientes.No entanto, instrumentos modulares e flexíveis podem ser vantajosos para laboratórios com um maior número de protocolos, volumes de amostras variados e mais utilizadores que dependem do mesmo instrumento para os seus próprios ensaios, bem como para laboratórios que possam querer expandir a sua capacidade de produção no futuro.
1. PCR x qPCR x dPCR
